单细胞分泌（功能）蛋白质组学技术揭示了同时分泌多种细胞因子的少数高度多功能细胞亚群（subsets of highly-polyfunctional cells），这些超级细胞可以预测患者在体内的反应和疾病进展，负责协调免疫反应和加速先进治疗药物的开发。
目前最被关注的肿瘤免疫治疗方法包括以PD-1/PD-L1抗体为代表的免疫检查点抑制剂疗法、以CAR-T为代表的细胞免疫疗法、肿瘤疫苗以及小分子抑制剂等新兴免疫疗法。近年来，大量以免疫单药及联合治疗的临床研究在国内外陆续开展，取得了多项令人振奋的结果，肿瘤免疫治疗生物标记物在治疗和预后预测中也展现出相当的潜力。然而，免疫疗法的作用机制比我们想象的更为复杂，受益群体相对有限，大多情况下只有少部分癌症患者能够从中获益，PD-L1表达、肿瘤突变负荷（TMB）、高度微卫星不稳定（MSI-H）等生物标志物无法完全满足临床需求，亟需探索更好的生物标志物。
单细胞分泌蛋白组学兴起
免疫细胞在抗肿瘤、抗感染等免疫应答中发挥重要作用，细胞因子就像免疫细胞的“武器”，可以帮助免疫细胞有效对抗“敌人”，抵御和清除肿瘤及自身损伤细胞。不同细胞因子表现出广泛的多效性，以协调先天性和适应性免疫系统，通过分析免疫细胞产生的细胞因子，可以帮助分析和评估细胞的免疫功能。有些免疫细胞不仅分泌一种细胞因子，可能分泌两种、三种、四种或以上，可分泌两种及以上细胞因子的细胞称为“多功能细胞”（polyfunctional cells或multifunctional cells），在过去的十多年有很多研究发现，这群细胞比只分泌一种细胞因子的细胞（单功能细胞）的功能更强，在体内产生的免疫应答更有效更持久。
传统的细胞因子检测技术，如ELISA、流式微球分析（CBA，Cytometric Bead Array）、芯片多因子检测等都是检测血清或细胞培养上清中群体细胞的平均蛋白信号，不能区分这些因子是由哪些细胞分泌的，也无法分辨单细胞分泌多种因子的多能性及共分泌的协同效应，掩盖了细胞分泌功能的异质性。因此单个因子的检测浓度高低，往往不能很好预测患者免疫治疗的疗效。
IsoPlexis单细胞功能蛋白质组学技术开创性地实现了单细胞水平对直接发挥功能的活细胞分泌蛋白组进行全自动检测，通过微流控芯片捕获单细胞、进行活细胞培养、逐一检测每个单细胞分泌的多达32种细胞因子，通过生信软件自动数据分析和可视化。对比分析免疫细胞亚群的细胞因子分泌差异，将不同细胞因子种类和信号强度关联到相应细胞功能，研究免疫细胞亚群功能异质性和多功能性，找到在免疫应答反应中具有超强作战能力的“超级英雄细胞”，并生成独特的“细胞多功能指数（PSI）”，更全面地分析免疫细胞的综合功能。单细胞功能蛋白质组学技术，成为免疫治疗研究中生物标志物探索的有利新工具。
单细胞分泌蛋白组学提供的数据
以德克萨斯大学MD安德森癌症中心Adi Diab等发表在Journal of Clinical Oncology的文章为例：在BEMPEG（改造的偏向性IL-2受体激动剂）+ Nivo（PD-1单抗）联合治疗转移性黑色素瘤II期临床研究中，研究者在用药前后不同周期采集患者外周血PBMC，通过IsoPlexis单细胞功能蛋白质组学技术检测CD4+T、CD8+T细胞的细胞因子分泌谱，包括发挥免疫效应功能、免疫刺激作用、趋化作用、免疫调节、炎症相关功能的五大职能32种细胞因子的检测分析。回顾性分析与患者预后和疗效相关的生物标志物，包括：
- 应答组和非应答组受试者治疗前（C1D1）、治疗后（C1D8）外周血CD8+T细胞分泌因子差异分析；
治疗一周后，应答组细胞因子分泌多样性更高，多因子组合的分泌频率更高（横向条块颜色越深，比例越高），主要由具有效应功能的细胞因子所驱动，其他趋化性、刺激性和调节性细胞因子也有不同程度的贡献；
- 根据细胞因子分泌差异，分析应答组和非应答组受试者治疗前（C1D1）、治疗后（C1D8）外周血CD8+T细胞多功能性（可分泌多种因子的细胞占比）；
治疗一周后，应答组多功能性CD8+T细胞增多；
- 分析应答组和非应答组受试者治疗前（C1D1）、治疗后（C1D8）外周血CD8+T细胞多功能指数（结合多功能细胞比例及其分泌的各种因子的信号强度）；
治疗缓解组（CR+PR）患者的CD8+ T细胞的PSI升高约2.2倍，具有显著差异（P＜0.01）；
细胞多功能指数（PSI），是结合多功能细胞比例及其分泌的各种因子的信号强度的综合评价指标。
- 治疗后与基线样本配对分析，外周血免疫细胞PSI中值变化倍数（PSD）；
CD8+T细胞PSD与客观缓解率（ORR）显著相关，可成为与患者应答呈正相关的预测性血液生物标志物；
- 长期随访，分析PSD（ PSI中值变化倍数）与患者无进展生存期（PFS）的关系；
在为期3年的研究过程中，CD8+T细胞PSD高的患者表现出更好的远期预后效果，或治疗结果改善。
本研究证明了BEMPEG + Nivo联合免疫疗法治疗转移性黑色素瘤的有效性和安全性，IsoPlexis的细胞多功能指数（PSI）及其变化倍数（PSD）是有效预测患者总体缓解率的关键指标。
IsoPlexis平台分析的预测性血液生物标志物，使研究人员能够比以前的传统技术更早地评估患者对Nivo/Bempeg治疗的反应。加速对难治性癌症的洞察，如转移性黑素瘤，鉴别与患者持久反应相关的治疗。
IsoPlexis单细胞功能蛋白质组学技术，正在被越来越多的研究者选择，在肿瘤免疫疗法开发和临床研究中，帮助研究者进行相关生物标记物的检测分析，揭示患者临床获益或耐药相关的机制，以更好地实现精准治疗从而选择最为适合的治疗方案。
IsoPlexis在肿瘤免疫临床和临床前研究中的代表文献
参考文献：
AdiDiab, et al. Bempegaldesleukin Plus Nivolumab in First-Line Metastatic Melanoma.Journal of Clinical Oncology, 2021: DOI https://doi.org/10.1200/JCO.21.00675
