单细胞技术哪家强，翌圣生物来帮忙。

一

单细胞技术介绍

单细胞测序技术，简单来说，就是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术。传统的测序，是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息，从而很好的解决了这一问题。

二

单细胞技术类型

单细胞技术类型很多，有单细胞转录组、单细胞基因组、单细胞表观组（单细胞ATAC、单细胞CUT&Tag、单细胞甲基化、单细胞Hi-C等）、单细胞蛋白组、单细胞代谢组等，各种技术不断迭代，检测灵敏度也不断提升。

在众多细胞技术中，应用最广泛的当属单细胞转录组了。

单细胞转录组也分为低通量的smart-seq1/2/3和高通量的微流控和微孔板等研究。

今天我们要介绍的主角是Smart-seq2

三

单细胞技术类型

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Smart-seq技术于2012年由Ramsköld团队发表；

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Smart-Seq2技术于2013年及2014年由Picelli团队改进并发表；

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Smart-seq3技术则于2020年由瑞典卡罗林斯卡学院的Rickard团队进一步改进并发表。

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虽然Smart-seq技术也迭代了多个版本，但是迄今为止，Smart-Seq2是使用最多且被广泛认为更稳定的技术类型，也是国内市场众多科技服务公司推崇的技术之一。

3.1

Smart-seq2技术原理

Smart-seq2关键技术原理有：

 01 

MMLVRT

使用的MMLV具有链置换活性和末端转移酶活性。其在逆转录到达mRNA 5’端末端时，会在新合成的cDNA的3’末端多出几个C碱基；

02 

TSO引物序列

TSO引物的5’端含有1个通用引物序列，而在其3’端，有两个核糖鸟苷（rG）和一个锁核苷酸（LNA）修饰的鸟苷（G），可以促进模板转换，进而扩增出完整的cDNA序列；

03 甜菜碱、海藻糖的添加

某些物种RNA中有发夹结构、环形结构等二级结构容易形成空间位阻影响逆转录酶结合，添加甜菜碱和海藻糖能在一定程度上增加酶的热稳定性，同时破坏RNA的空间位阻。同时，甜菜碱和Mg2+同时存在，能在一定程度上提高cDNA产量。

单细胞分离方法很多，有梯度稀释法、口吸管移液法、自动显微操作法、显微切割法、流式分选法等，不同的方法对比如下：

3.4

Smart-seq2技术与其他单细胞技术对比

单细胞技术除了Smart-seq、Smart-seq2和Smart-seq3之外，还有CEL-seq2/C1、Drop-seq、MARS-seq、SCRBseq。文章Ziegenhain C, Vieth B, Parekh S, et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Mol Cell. 2017;65(4):631-643.e4. doi:10.1016/j.molcel.2017.01.023从不同角度来对单细胞技术进行评估，综合来看，Smart-seq2更胜一筹。

六种测序方法都有比较好的测序质量，均超过 50% 的数据成功被 mapping到。另外，可以明显发现基于全长测序方案的 Smart-seq 较 UMI，外显子区域的 reads 更多，其中 smart-seq2 有 48% 的 reads 比对到外显子区域（如下图）。这表明 Smart-seq2（48% reads 比对到外显子）和 Smart-seq（30% reads 比对到外显子）较 UMI 方案（均低于 15% reads 比对到外显子）有更好的测序质量。

基因检测效率对比

采用抽样的饱和度分析对测序深度进行评估，当测序深度达到 100 万reads时，这六种测序方法均可达到饱和，但明显 Smart-seq2 具有更好的基因检测效率。

单个细胞进行实验时的敏感度对比

在相同的单个细胞进行单细胞建库，相同的测序深度下，检测单细胞中基因表达数量。结果发现，Smart-seq2 敏感度最好，达到中位数 9138/cell，而最低的是 Drop-seq 和 MARS-seq，分别约为 4811/cell 和 4763/cell。

多个细胞进行实验时的敏感度对比

多个细胞建库后的reads合在一起进行生信分析，结果发现，Smart-seq2 仍然具有更多的基因被检测到，MARS-seq 仍然具有最少的基因被检测到，这与单细胞敏感度检测是一致的。

单细胞建库结果重复性对比

利用 92 个已知的外源 ERCC 转录本，进一步采用线性模型拟合了观测的表达值与已知浓度的相关系数（R2）。通过分析发现，这六种方法的相关系数都较高，都高于 0.80 的相关系数。这表明这六种方法的准确度都较好，但 Smart-seq2 的相关系数为 0.91，而 MARS-seq 相关系数为 0.83。

不同单细胞技术的Drop out对比

对至少 65 个单细胞分析中发现，13361 个基因在 25% 的细胞中至少被一种方法检测到表达，那么挑选这些基因进行分析，MARS-seq 具有最高的 drop out 中位概率（74%），而 Smart-seq2 最低（26%），此时说明 Smart-seq2 具有更好的敏感度，这与之前的敏感度也是对应的。

看了以上结果，是不是对Smart-seq2技术更心动了呢，如果你有需求，联系翌圣获取详情吧！

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四

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