Q&A

Q: 类器官是由单一种类细胞组成的还是多细胞组织？
类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。类器官并不是单一细胞组成的结构，而是由具有干细胞性质的起始细胞进行诱导后分裂和分化，并将多种类型的细胞自组装成具有一定空间结构，形态和功能与体内相应器官相似的组织类似物。

Q: 类器官培养其样本来源有哪些类型？
（1）多能干细胞来源的类器官包括：成体干细胞 (ASC)/多能性干细胞 (PSC) /以及诱导多能干细胞(iPSC)。
（2）组织提取细胞来源的类器官，常见于肿瘤组织。

Q：在没有新鲜组织的情况下，可以用冻存组织进行3D培养吗？
可以，但对冻存组织的大小有较高要求，且原代冻存组织及细胞活性会明显下降，从而导致后续培养成功率大大降低。

Q：类器官如何进行冻存和复苏？
类器官的最好选择在P2-P5代次时冻存，此时类器官活性和分化性能都是最优状态。类器官的复苏可以参考细胞的复苏方法

Q：培养的类器官尺寸需要进行控制吗，太大会好吗？
需要，最好控制在500um以内，类器官内部缺乏血管及气液循环系统。

当类器官的尺寸较大时，靠近中心的细胞难以和外界进行氧气和营养成分的交换。因此这个结构尺寸越大，死亡的细胞就越多

Q：培养类器官除了使用基质胶，还可以使用什么？
除了使用基质胶，还可以使用①去细胞外基质和其他衍生蛋白质②合成水凝胶③工程化重组蛋白凝胶等进行替代。

Q:如何实现类器官的进行定向分化？
干细胞诱导分化的类器官早期发育过程受到多种信号通路的共同调控。在体外培养中，需要通过添加细胞因子来模拟这些信号通路的活动，以引导细胞在特定的方向分化。例如，通过Y27632、Activin A诱导可以将胚胎干细胞（PSCs）或多能干细胞（iPSC）分化为内胚层细胞（EB），再通过Wnt3a、FGF-4和Noggin等因子调控信号通路，从而诱导干细胞细胞向特定方向分化。

Q：获取临床样本，如何避免污染？
① 取材时尽量保证无菌取材；
② 提取前可以用含双抗的pbs浸泡几分钟：常见与外界环境有接触可能的胃、肠、膀胱等位置肿瘤建议用含3%-5%双抗的pbs浸泡5-10min，其他常见肿瘤用含1%-2%双抗的pbs浸泡5min左右；
③提取细胞过程中所用试剂均加1%双抗及合适浓度的原代抗生素。

Q:肿瘤组织采集、保存、运输注意事项
尽可能多采集肿瘤细胞含量高的肿瘤组织，并缩短组织样本在空气中暴露的时间，以减少污染概率；采集的肿瘤组织样本尽快置于装有专用样本保存液的无菌管中，低温（4 ℃左右）下快速运转至检测单位（尽量保证采样后2~4 h内送到）；

Q：病灶和癌旁培养出的类器官有区别吗？肿瘤组织的取材部位有什么要求？
有差别，肿瘤本身具有异质性，不同来源的类器官之间存在差异是很常见的现象，从形态上看，原发病灶来源的类器官比癌旁来源的类器官更具有侵袭性的结构，一般病灶形态上更加不规则一些。如果希望在建模或药物筛选方面尽量减小误差，可以在活性好的地方多位置取样。

Q： 可用于肿瘤类器官药物敏感性检测的药物类型？
临床主要的抗肿瘤药物类型可归纳为三大类，包括细胞毒药物（化疗药物如紫杉醇、顺铂/卡铂、5-FU 等）、靶向药物（靶向EGFR、HER2、VEGFR等靶点的药物）以及以免疫检查点抑制剂为代表的免疫治疗药物（PD-1抗体、PD-L1抗体等）

Q：PDO培养的成功率是多少？
不同类型来源的PDO在培养过程中的成功率略有不同，大部分的PDO培养成功率在63%至70%之间，甚至更高，达到90%，这跟组织本身活性相关性比较大。此外，临床治疗对于成功率的统计结果有一定影响。通过缩短样本的离体时间和操作步骤，可以适当提高成功率。

Q：冰冻组织可以用于类器官培养？
一般不建议组织冷冻保存，活率损失会比较大，但如果冷冻保存在-80℃条件下，最佳的类器官培养窗口是在保存后的6周内，如果组织保存在液氮中，其保存时间可以更长但最好不要超过半年。

Q：原代细胞提取时，通常会混有成纤维细胞，应如何处置？
（1）可以根据成纤维细胞贴壁不牢的特性，采用反复贴壁的方式去除大部分成纤维细胞。
（2）采用成纤维细胞去除试剂，但是否会影响类器官的培养还需要实验验证。

Q：培养肿瘤类器官需要多大原始肿瘤组织比较好？活检样本量足够吗？
手术组织所需的原始肿瘤组织大小通常应大于2-3颗黄豆大小；若使用穿刺活检方式获取样本，则至少需要2-3条穿刺样本，而内镜活检需要至少钳取6颗以上肿瘤组织。

Q：样本肿瘤组织偏小，培养的类器官数目不足以进行后续检测，怎么办？
由于肿瘤来源的类器官在传代后可能会出现表型上的差异，一般不建议进行传代。文献中一般推荐将类器官的传代控制在2-3代，并且最多不超过5代。如果细胞数目太少，经过5代的传代仍然无法满足测试需求，可以考虑改变检测方式，例如将96孔板换成更小的384孔板，甚至尝试使用微流控芯片等更小的体系进行测试。

Q：肿瘤组织中会存在正常细胞吗？怎么去除这些正常细胞？
会存在少部分正常细胞，首先是取材时尽量避免取到正常组织，其次，提取原代细胞后可以进行磁珠分选或流式分选后再进行类器官培养。极少量存在正常细胞时，对后续类器官建模培养影响不大，也可不去除。

Q：从肿瘤组织中提取原代细胞，为什么细胞呈红色？
组织在体内时供血丰富，存在较多红细胞，不是很多的情况下不用处理，不影响类器官培养，较多红细胞时可以适当用裂红液处理后再进行培养。

Q：类器官培养过程中发现有黑色小颗粒，如何去除？
黑色小颗粒大概率是杂质或细胞碎片，去除它们有以下两种方式可以参考：
1、将类器官消化下来，用培养基进行反复清洗，达到稀释杂质的作用；
2、用无菌手术刀将类器官切成两半，取1ml注射器吸满培养基并轻轻推出，冲洗类器官中的杂质

Q：类器官传代有次数限制吗，可以进行多少次传代？
传代次数一般由来源细胞性质决定，大部分类器官可以在体外连续传代10次（>6个月），培养基条件的选择也可能会有一定影响，条件培养基一般会优于合成因子培养基。

Q：肿瘤细胞系（如HepG2细胞系）可以培养成为PDO吗？
PDO是复杂的自组装结构，单一细胞系形成的3D培养体系无法称之为PDO，只能是称为3D球状态。

Q：类器官传代的标准是什么？
依据类器官的发育状况，不同类器官时间不同，通常5-10日、直径100-200um左右可以传代，有些发育慢的可能要数周才能发育到适合传代状态。

Q：活类器官数量如何进行计数
实验时,取出已经配置好的钙黄绿素储存液,加入钙绿黄素溶液到培养基中至终浓度为0.2μmol/L。随后在 37℃条件下孵育 60 min。到达时间后,用 PBS缓慢清洗掉带有钙绿黄素的培养基,加入新鲜培养基。用 490 nm 激发波长,515 nm 发射波长的滤光片的荧光显微镜观察类器官并拍照。活类器官在荧光显微镜下显示为绿色且边缘清晰。对直径>20μm的活类器官计数。

Q：类器官存活率的计算

类器官存活率按照公式进行计算:   X=(N活/N总)x100%     其公式中:
X——代表类器官存活率;
N活——代表活类器官数量;
N总——代表总类器官数量。

Q：鉴定类器官的方法有哪些？
最基础的通过显微镜和H&E染色观察类器官形态；进一步可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫荧光、流式细胞术检测该类器官是否表达相应的biomarker；基因测序可以鉴定所培养的类器官与源组织的基因匹配度；对于部分类器官，还可以检测其是否具有功能，例如：已有研究检测出胃类器官可以分泌胃酸，心脏类器官可以自主跳动。

Q：正常细胞是否也会生长为类器官？肿瘤类器官培养时怎么去除正常类器官？
正常细胞也可生长为类器官，去除正常类器官方法：①依据HE鉴定结果的形态显微镜下手动筛选；②通过调节培养基组分（细胞因子/小分子抑制剂等）进行筛选纯化PDO；③将PDO分散为单细胞后进行流式或磁珠分选。

Q：进行药敏实验时，需要将PDO从基质胶中消化下来吗？
不需要，PDO需要有三维结构才能模拟体内情况。如果没有基质胶的支持，药物敏感性实验的准确性将受到影响。一般溶解性药物均可穿透基质胶作用于类器官，但进行免疫杀伤实验时，是需要去除基质胶的。

Q：PDO实验可以完全代替动物模型（PDX）吗？
能部分替代PDX，不可以完全替代，动物模型可以更好的模拟药物代谢、肿瘤浸润和转移及一些更为复杂的病理过程。是PDC，PDO无法替代的。

Q：在培养过程中，PDO生长情况与之前相比异常，主要表现为生长周期变短，增殖迅速，这是什么原因？
外因：①这种异常可能是由某些杂质细胞（如成纤维细胞）的大量生长引起的。在这种情况下，建议进行切片染色并观察，以确定是否存在这些细胞的污染再进一步去除；②培养基条件改变，某些因子或小分子的加入可以进一步激活PDO的增殖通路。

内因：可能的基因突变。为了验证这一点，最好进行测序，并将结果与初代PDO进行比对，以确定是否存在基因突变。

Q：怎样检测PDO对药物的敏感性？
可以通过CCK8检测、ATP细胞活性检测、活死染色法等对类器官进行药物敏感度检测。检测肿瘤类器官的ATP活力值是最常用的方法。ATP是细胞内最重要的能量分子，可以用来衡量细胞新陈代谢水平，反映活细胞的数目。基于给药对细胞ATP含量的影响，进一步利用分析软件计算每组药物方案的IC50值（被测药物的半抑制浓度），来筛选出对肿瘤抑制效果最佳药物。

Q：PDO和肿瘤原代细胞的药敏实验浓度范围相同吗？
不相同，通常PDO的给药浓度要高于原代细胞，在正式药敏实验时可以先进行预实验分析。

Q：类器官一般长到什么程度可以用来进行药物测试？
一般推荐药物测试选用5代以内的类器官，此时的类器官遗传稳定性和活性都是最好的。

Q：类器官建立是否成功有怎样的标准吗？
①最早期的初步判断：类器官的形态改变从细胞状态分化出空泡状、出芽状、紧密型、松散型等形态。②通过鉴定特定的生物标志物是否表达，并与组织切片的分布相似。进一步的可以进行测序分析以获得更详细的比对信息来判断。

Q：类器官培养和普通细胞培养有何不同之处？
（1）细胞培养方式不同：类器官需要借助基质胶或空间结果等支撑物来维持其三维结构，而普通细胞培养则不需要；

（2）类器官的培养需要实现体外分化和自组装，因此需要使用多种细胞因子的组合诱导，所需培养基成分相对复杂。而普通细胞培养通常只涉及单一类型的细胞，所以培养基成分相对简单；

（3）细胞来源不同：类器官的细胞来源是具有多能性的上皮细胞，而普通细胞培养适用于培养多种类型人为筛选细胞。

Q：我培养出的3D球不知道是不是类器官，怎么判定与目标组织具有一致性？
类器官鉴定方法包括HE染色、ICH、单细胞测序等多种方法，需要从形态学、组织病理学及分子遗传学等多维度进行判定是否与目标类器官或组织一致，如果是肿瘤类器官可以通过检测标志物判断，下表节选自NCCN指南和相关文献仅供参考：

Q: 按照文献方法进行类器官培养，观察到类器官的形态与文献有差异，是什么原因？

首先，不同个体样本来源差异和分型不同且也存在异质性；其次，选用的细胞因子及一些小分子抑制剂的品质是否有差异都有可能导致不同类器官分化形态。建议通过HE，IHC，基因测序等方法与源组织确定类器官形态与源组织是否具有一致性，并不一定局限于文献形态。

Q：类器官的药敏实验中需要使用DMSO作为药物的溶剂，需要控制DMSO的用量吗？

需要，一般药敏实验要求dmso的体积含量小于0.5%。

Q：类器官怎么从基质胶中回收？

①比较推荐：市售有类器官回收液（CAT#41421ES），可以温和有效地获得细胞悬液，不会损伤细胞或细胞表面蛋白。

②低温融解基质胶，利用基质胶本身性质低温使基质胶软化释放类器官。

Q：在类器官回收时，会有不少类器官粘附在离心管壁，如何提高回收率？

收集后离心时用水平转子离心机，可以适当提高一点离心机转速，一般300g左右离心力，转速大概是1000-1200rpm。

参考文献：

【1】王树滨,高静,朱宇等.类器官药物敏感性检测指导肿瘤精准治疗临床应用专家共识(2022年版)[J].中国癌症防治杂志,2022,14(03):234-239.
【2】团体标准：T/CSCB 0014-2022，人肠癌类器官
【3】团体标准：T/CSCB 0013-2022  人肠道类器官
【4】Toshio,Takahashi.Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine.[J].Annual review of pharmacology and toxicology, 2018.DOI:10.1146/annurev-pharmtox-010818-021108.
【5】Yang H ,Wang Y ,Wang P , et al.Tumor organoids for cancer research and personalized medicine[J].Cancer Biology Medicine,2022,19(03):319-332.
【6】https://www.nccnchina.org.cn/guide/index

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