1. 背景描述：
相比较于传统的生色法和化学发光法只能定性和半定量检测一个蛋白的局限性，荧光WB不仅能在定性的同时实现蛋白定量，而且还兼容多色荧光抗体的优越性，同时完成二个或者更多蛋白的检测。因此对荧光WB技术的发展是科研水平进步的必然需求。而荧光WB实验技术的开展步伐也一直受检测仪器和荧光染料开发限制。现在这两项技术已经逐步成熟。
A 荧光Western Blots与检测仪器
目前应用最普遍的荧光WB成像仪是LI-COR Odyssey Infrared Imaging System（见下图）。
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染料名称 |
灵敏度 |
Odyssey通道 |
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IRDyeTM 800/ IRDyeTM 800CW |
+++ |
800 |
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IRDyeTM 700DX |
++ |
700 |
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Alexa Fluor® 680/ Dylight TM 680 |
+++ |
700 |
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Alexa Fluor® 700 |
++ |
700 |
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Alexa Fluor® 750 |
++ |
700/800(不推荐使用，双通道都能检测到信号) |
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Dylight TM 800/Alexa Fluor® 790 |
+++ |
800 |
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Cy® 5.5 |
++ |
700 |
B 荧光Western Blots与荧光染料
Alexa Fluor®是invitrogen公司的**产品，其下不同波长的产品是目前市场上口碑最高的荧光染料之一。Alexa Fluor® 680是一种远红外（far-red，红外光谱中离红色可见光最远的光）发射染料，Ex= 684nm，Em=702nm。Alexa Fluor® 790是一种红外(Infrared,波长范围在750 nm~1 mm)发射染料，Ex= 783nm，Em=803nm（光谱见下）。
与标记常用可见光染料的抗体相比具有：更高灵敏性，更低荧光淬灭性；高消光系数和低自发荧光背景的特点。因此可用于更多的免疫荧光检测和成像系统。Alexa Fluor® 680/790标记抗体的应用有：
·高灵敏度Western Blotting；·荧光定量Western Blotting； ·In-gel Western Blotting；
·MicroWestern arrays； ·In-cell Western arrays； ·On-cell Western arrays；
·Tissue section imaging； · small animal whole body imaging ；
2. Alexa Fluor® 680/790荧光抗体应用实例：
Jackson Immunoresearch提供Alexa Fluor® 680/790荧光染料标记的信号增强型一抗，亲和纯化二抗（单标/多标实验），链霉亲和素和IgG对照品。该类抗体标记具有很高的灵敏性，推荐抗体稀释范围为1:50,000-1:200,000。
图片描述：
用Alexa Fluor® 680和Alexa Fluor® 790标记抗体进行免疫荧光Western blot实验。检测系统为LiCor Odyssey成像仪。其中，Mouse IgG和goat IgG用β巯基乙醇和SDS进行还原和变性，用SDS-PAGE电泳分离重链和轻链，电泳后转移到NC膜上，用Alexa Fluor® 790-goat anti-mouse IgG, Fcγ Subclass 1 specific (min X Hu, Bov, Rb Sr Prot, 115-655-205)(稀释比例1:100,000，绿色)检测重链，并用Alex Fluor® 680-goat anti-mouse IgG, light chain specific (min X Bov, Gt, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Ig, 115-625-174)( 稀释比例1:100,000，红色)检测轻链。Goat IgG用来作为背景对照，实验中Goat IgG重链和轻链的微弱条带表明即使稀释比例为1:100,000，Alexa Fluor® 680和Alexa Fluor® 790染料仍具有亮度。
3. Alexa Fluor® 680/790常用荧光产品（更多请见官网）
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Streptavidin and Antibody Description 链霉亲和素和抗体描述 |
Alexa Fluor®680 |
Alexa Fluor®790 |
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Streptavidin 链霉亲和素 |
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Donkey Anti-Chicken IgY†(IgG)(H+L) 亲和纯化驴抗鸡IgY(IgG)(H+L)二抗 (经牛,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,小鼠,兔,大鼠,绵羊血清吸附) |
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Donkey Anti-Goat IgG (H+L) 亲和纯化驴抗山羊IgG(H+L)二抗 (经鸡,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,小鼠,兔,大鼠血清吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Goat IgG , Light Chain Specific 单克隆小鼠抗山羊IgG,轻链二抗 (经马,人,小鼠,兔,大鼠免疫球蛋白吸附) |
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Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) 亲和纯化驴抗豚鼠IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,叙利亚仓鼠,马,人,小鼠,兔,大鼠,绵羊血清吸附) |
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Goat Anti-Armenian Hamster IgG (H+L) 亲和纯化山羊抗亚美尼亚仓鼠IgG(H+L)二抗 (经牛,人,小鼠,兔,大鼠血清吸附) |
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Donkey Anti-Human IgG (H+L) 亲和纯化驴抗人IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,小鼠,兔,大鼠,绵羊血清吸附) |
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Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific 亲和纯化山羊抗人IgG,Fcγ片段二抗 (经牛,马,小鼠血清吸附) |
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Goat Anti-Human IgM, Fc5µ fragment specific 亲和纯化山羊抗人IgM,与 Fc5µ片段特异性反应 (经牛血清吸附) |
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Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) 亲和纯化驴抗小鼠IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,兔,绵羊血清吸附) |
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Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) 亲和纯化驴抗小鼠IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,兔,大鼠,绵羊血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 亲和纯化驴抗小鼠IgG(H+L)二抗 (经人,牛,马,兔,Sw血清吸附) |
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Antibody Description |
Alexa Fluor®680 |
Alexa Fluor®790 |
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Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 亲和纯化山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗 (经大鼠,人,牛,马,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG Fcγ fragment specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG,Fcγ片段二抗 (经人,牛,马血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgM, μ chain specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG,与μ链特异性反应 (经人,牛,马血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 1 specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG,与Fcγ亚型1特异性反应 (经人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 2a specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG, 与Fcγ亚型2a特异性反应 (经人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 2b specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG, 与Fcγ亚型2b特异性反应 (经人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 2c specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG, 与Fcγ亚型2c特异性反应 (经人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Fcγ subclass 3 specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG, 与Fcγ亚型3特异性反应 (经人,牛,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Mouse IgG, Light Chain Specific 亲和纯化山羊抗小鼠IgG,与轻链特异性反应 (经牛,山羊,马,人,兔,大鼠,绵羊免疫球蛋白吸附) |
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Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) 亲和纯化驴抗兔IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,小鼠,大鼠,绵羊血清吸附) |
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Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)二抗 (经人,小鼠,大鼠血清吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Rabbit IgG , Light Chain Specific 单克隆小鼠抗兔IgG,与轻链特异性反应 (经牛,山羊,ArmH小鼠,马,人,小鼠,大鼠,绵羊免疫球蛋白吸附) |
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Antibody Description |
Alexa Fluor®680 |
Alexa Fluor®790 |
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Donkey Anti-Rat IgG (H+L) 亲和纯化驴抗大鼠IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,兔,绵羊血清吸附) |
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Donkey Anti-Rat IgG (H+L) 亲和纯化驴抗大鼠IgG(H+L)二抗 (经牛,鸡,山羊,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,小鼠,兔,绵羊血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgG (H+L) 亲和纯化山羊抗大鼠IgG(H+L)二抗 (经人,牛,马,兔血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgG, Fcγ fragment specific 纯化山羊抗大鼠IgG,与Fcγ片段特异性反应 (经人,牛,马血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgM, μ chain specific 纯化山羊抗大鼠IgM,与μ链特异性反应 (经人,牛,马血清吸附) |
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Goat Anti-Rat IgG, Light Chain Specific 亲和纯化山羊抗大鼠IgG,与轻链特异性反应 (经牛,山羊,马,人,小鼠,兔,绵羊免疫球蛋白吸附) |
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Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) 亲和纯化驴抗绵羊IgG(H+L)二抗 (经鸡,豚鼠,叙利亚仓鼠,马,人,小鼠,兔,大鼠血清吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Sheep IgG, Light Chain Specific 单克隆小鼠抗绵羊IgG,与轻链特异性反应 (经牛,马,人,小鼠,兔,大鼠免疫球蛋白吸附) |
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Mouse Monoclonal Anti-Fluorescein 小鼠抗荧光素FITC单克隆抗体 |
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Mouse Monoclonal Anti-Digoxin 小鼠抗地高辛单克隆抗体 |
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Mouse Monoclonal Anti-Biotin 小鼠抗生物素单克隆抗体 |
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Controls |
Alexa Fluor®680 |
Alexa Fluor®790 |
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ChromPure Donkey IgG, whole molecule 色谱级驴IgG,完整分子 |
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ChromPure Goat IgG, whole molecule 色谱级山羊IgG,完整分子 |
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ChromPure Mouse IgG, whole molecule 色谱级山羊IgG,完整分子 |