白血病细胞株培养指南
白血病细胞与其他肿瘤细胞一样具有异常的形态、代谢及功能。它的生长极旺盛，失去分化成熟的能力及其相应功能。不同的是就单个白血病细胞来说在光镜下常常与相同阶段的正常造血细胞难以区别，恶性特征不如实体瘤（癌或肉瘤）细胞那样显著。
白血病细胞株培养指南:
在培养基中补充牛胎儿血清.HEPES，抗生素类化学物质，L-谷氨酰胺，通过悬浮培养，hl-60细胞能持续增值。加倍时间大约是36-48小时。这个细胞株是在National Cancer Institute[1]（美国国家癌症研究所）从一个36岁患急性早幼粒细胞白血病的男人身上得到的。
HL60细胞增值需要transferrin(转铁蛋白）和胰岛素受体，细胞表面表达有这两种物质。这两种物质是必须的，一旦这两种复合物任意一种从无血清培养基中除去，那么hl-60细胞立即停止增值。成熟的粒细胞自发分化可以用 dimethyl sulfoxide (DMSO)(二甲亚砜）retinoic acid（维甲酸）等化学物质诱导。其他诸如 1,25-dihydroxyvitamin D3（二羟维生素D). 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA）（对二苯甲酸），GM-CSF等化学物质能够分别诱导hl-60细胞分化出单核细胞，巨噬细胞，嗜酸性粒细胞的表型。
悬浮白血病细胞HL-60的培养上清液对HUVECs的血管形成能力的影响
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
1.1.1 细胞培养材料： RPMI1640培养基，小牛血清，人急性白血病细胞株（Hl-60），人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。
1.1.2 主要药品与试剂：二甲亚砜(DMSO）；MTT，Amresco公司产品；0.25%胰酶；HEPE；逆转录及PCR试剂盒；琼脂糖凝胶，美国Sigma公司产品。
2 实验方法
2.1 细胞培养： HL-60悬浮细胞、HUVECs在含10%小牛血清的1640培养液中于5%CO2恒温培养箱中常规培养。K562细胞每1-2天换液传代一次，HUVECs每2-3天换液传代一次。
2.2 MTT比色实验检测细胞增殖情况：取对数生长期HUVECs调整细胞浓度为1×105/ml，接种于96孔培养板，每孔100μL，每板种2组，每组十个复孔，共种3板。待4小时镜下观察细胞贴壁后，第一组每孔加培养12h的HL-60细胞上清100μL，第二组每孔加1640培养基100μL，分别培养24、48、72h后，每孔加入MTT（5mg/ml)20μL，继续培养4h，吸去上清液，每孔加DMSO180μL，在酶联免疫检测仪上以570nm为检测波长，读取吸光度（A）值。
2.3 RT-PCR技术检测HUVECs CyclinE及VEGF mRNA表达：a.对照组: 将HUVECs浓度调整为1×105/ml的细胞悬液,接种5ml于细胞培养瓶中，4小时镜下观察其贴壁后加入5ml培养基。 b.实验组: 将HUVECs浓度调整为1×105/ml细胞悬液,接种5ml于细胞培养瓶中，4小时镜下观察其贴壁后加入培养12h的K562细胞上清液5ml。两组细胞培养72h后，弃去培养瓶中培养液，PBS轻柔清洗细胞2-3次，Trizol法提取两组HUVECs总mRNA，按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录。以逆转录反应产物为模板按，按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增。根据文献报道[3]扩增CyclinEmRNA及VEGFmRNA的引物序列，并用Oligo引物设计软件检测。CyclinEmRNA上游引物：5-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3，下游引物：5-CCGCTGCTCTGCTTCTTAC-3。VEGFmRNA上游引物：5-CAAATCCACCCACTATGA-3，下游引物：5-CCGCCTCGGCTTGTC-3.β-action上游引物：5-ACACTGTGCCCATCTACGAGG-3 ，下游引物：5-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3。反应参数为：95℃预变性5min,95℃变性40s,53℃退火35s,72℃延伸35s，共30个循环，最后于72℃保温10min终止反应。然后取反应产物进行琼脂糖凝胶电泳。
2.4 统计学处理：实验结果采用SPSS13.0统计学软件进行统计学分析，数据用平均数±标准误表示（means±S.E.）。多组均数间的比较采用F检验。以P＜0.05或P＜0.01判断差异有统计学意义。 3 结果
3.1 K562细胞上清对HUVECs促增殖作用
噻唑蓝（MTT）还原法检测两组培养24、48、72小时后HUVECs增殖速度（图1）。结果显示实验组中HUVECs较对照组HUVECs增殖明显加快，并呈时间依赖性， 72小时后差异具有显著性意义（P<0.05）。
图1 两组培养24h、48h、72hHUVECs吸光值比较（n=10 *P<0.05） 3.2 实验组HUVECs较对照组HUVECs CyclinEmRNA表达明显增高
实验组、对照组培养72h后，RT-PCR检测显示：实验组HUVECs较对照组HUVECs CyclinEmRNA表达明显增加。灰度扫描显示实验组较对照组HUVECs CyclinEmRNA表达差异有显著性意义（P<0.01）（图2）。
图2 RT-PCR检测组两HUVECs CyclinEmRNA表达水平 （**p<0.01）
3.3 实验组HUVECs较对照组HUVECs VEGFmRNA表达明显增高
实验组、对照组培养72h后，RT-PCR检测显示：实验组HUVECs较对照组HUVECs VEGFmRNA表达明显增加。灰度扫描显示实验组HUVECs较对照组HUVECs VEGFmRNA表达差异有显著性意义（P<0.01）（图3）。
(上海拜力生物整理 “白血病细胞株培养指南” )