细胞疗法发展的一个主要挑战是在生产和生物工艺阶段确立产品功效和持久性的质量指标。在临床前对产品适用性进行表征至关重要，但事实上这项工作极具挑战性，因为目前的技术只提供细胞功能的间接测量。优化细胞治疗生物工艺，改善治疗效果，需要在单细胞水平上进行细胞因子分析以表征细胞治疗产品的功能。

IsoPlexis的IsoCode单细胞分泌组解决方案可以直接识别单个细胞分泌的一系列细胞因子，使研究人员对细胞功能有独特的见解。这使得高度多功能细胞（highly polyfunctional cells）的发现成为可能，“多功能细胞”是指可同时分泌多种细胞因子来执行多种功能的细胞群体，与细胞治疗产品的免疫活性和临床反应有关。

以下案例将展示如何借助IsoPlexis单细胞CAR-T解决方案为研究人员开发有效而持久的细胞疗法。

将多功能性作为细胞治疗产品的关键质量属性

在最近发表在《Nature Medicine》上的一项研究中，美国斯坦福大学研究人员Spiegel等人利用IsoPlexis平台揭示一种优化生产工艺的新方式，用于一种新型的CD19和CD22双靶点CAR-T产品（CD19-22.BB.z）的生产优化。在一项评估复发或难治性B细胞恶性肿瘤治疗的一期临床试验中，IsoPlexis单细胞功能蛋白质组学为预测CAR-T在体内的疗效提供了有意义的产品质量见解。

临床试验数据表明使用CD19-22.BB-CAR治疗大B细胞淋巴瘤（LBCL）后疾病进展与强大的早期应答及随后的早期获得性耐药性有关。研究人员发现了复发的一个功能驱动因素，这表明CAR-T生产的改进有可能防止抗原逃逸相关的耐药性。

研究人员发现，单细胞产生的功能蛋白是预测CAR-T细胞疗法效力的一个有意义的属性。

作者评价：“我们的结果表明，在基因编辑的CAR-T产品迭代中应借助单细胞CAR-T细胞多功能性谨慎评估，将细胞因子产生的多功能性作为一个关键的质量属性来指导工作开展。”

该文章强调了IsoPlexis如何为CAR-T疗法的产品表征、优化以及生产流程提供关键的预测指标。

CAR-T产品的生产工艺优化

随着CAR-T临床应用的扩大，自动化、全封闭细胞制造系统正在逐渐取代传统的劳动密集型、开放式培养方法。以下案例介绍采用全封闭自动化CliniMACS Prodigy设备对不同工艺程序生产的CAR-T细胞进行功能评估，以选择合适的工艺。

Case 1：

比较两种生产双特异性CD19 22 CAR-T细胞的自动化工艺

原始方法（OM）：即最初的方法，采用TransAct CD3/CD28试剂介导T细胞激活/刺激，然后进行慢病毒转导，在第5天结束洗涤步骤。

改良方法（MM）：采用TransAct CD3 / CD28试剂介导T细胞激活/刺激，然后进行慢病毒转导，在第3天结束洗涤步骤。

在OM运行中（T细胞的刺激和激活时间更长），有些更敏感的病人细胞出现细胞活力和扩增减弱。

一共对4例单采样本进行了评估，比较MM和OM方法生产的CAR-T细胞产品差异。除了终止洗涤的时间外，其他工艺保持不变。在培养7-12天之间收获细胞，以保证达到细胞数目要求。

采用流式检测CAR转导效率及细胞免疫表型。对于细胞功能评估，则采用IsoCode单细胞分泌蛋白组技术分析抗原特异性多功能细胞因子的表达。

CAR-T生产及检测流程图

数据显示，与原有OM方法相比，MM改良法可促进CD4或CD8 CAR - T细胞产物对CD19或CD22的多功能性反应。而且，在对配对的多例病人样本进行单独分析时，这些结果表现出一致性。因此，最终采用MM法进行临床级别的CD19/CD22双特异性CAR-T细胞生产。

Case 2：

在CAR-T生产中选择更优的IL-7制剂

IsoPlexis单细胞功能蛋白质组学解决方案使研究人员能够通过测量细胞外功能对单个免疫细胞进行表型分析，为细胞治疗性能提供预测性的质量见解。

在新近发表在《Nature Communications》上的一项研究中，来自圣路易斯华盛顿大学的Kim等研究人员的工作重点在于比较重组人IL-7与Fc融合蛋白 （rhIL-7- hyFc）是否像rhIL-7一样增强CAR-T细胞的功能活性，而后者已在临床试验中使用，并显示其耐受性良好，可显著增加人体的T细胞数量。若是如此，这种长效作用的rhIL-7-hyFc的方便性将使其成为进入人体临床研究的首选药物。

结果显示，尽管rhIL-7- hyFc可介导强大的UCART19细胞扩增，但并未发现任何功能上的损失（通过PSI定义）。从实验第0天开始，rhIL-7- hyFc扩增的UCART19细胞保持了与UCART19细胞相似的细胞因子分泌谱和PSI。

这些数据证实了rhIL-7-hyFc不仅可增强功能性UCART19细胞的体外扩增，并维持了CAR-T细胞的多功能性。

IsoPlexis单细胞细胞因子分析结果也支持小鼠动物模型体内结论，即rhIL-7-hyFc促进人CAR-T细胞在CD19+荷瘤NSG小鼠中的持久性，增强抗肿瘤功效，从而延长无瘤生存时间。因此，rhIL-7-hyFc是一种可调的临床即用佐剂，以改善CAR-T细胞的功能活性。

Case 3：

采用可定制规模的搅拌式生物反应器实现异基因T细胞治疗

为了评估T细胞在搅拌式生物反应器中扩增后的功能状态，研究人员评估了T细胞在刺激后产生细胞因子的能力。第0天和第14天获得的T细胞样本中分离CD4+和CD8+ T细胞，纯度为98%。

数据显示，在经过搅拌式生物反应器扩增后，T细胞依然保持较高的多功能性，尤其CD8细胞的多功能性显著提高。

与第0天相比，第14天的样本显示产生5种以上细胞因子的T细胞数量增加。即使频率较低，第14天T细胞产生的细胞因子种类最多，CD4+ T细胞可产生11种细胞因子，CD8+ T细胞可产生9种细胞因子。

此外，基于细胞因子特征的细胞类型分类表明，在保留刺激特征的同时，效应因子的多功能强度指数增加。

参考文献：

• Spiegel JY, Patel S, Muffly L, et. al. CAR T cells with dual targeting of CD19 and CD22 in adult patients with recurrent or refractory B cell malignancies: a phase 1 trial. Nat Med. 2021 Aug;27(8):1419-1431.
• Kim MY, Jayasinghe R, Devenport JM, et. al. A long-acting interleukin-7, rhIL-7-hyFc, enhances CAR T cell expansion, persistence, and anti-tumor activity. Nat Commun. 2022 Jun 13;13(1):3296.
• Gatla H, Uth N, Levinson Y, et. al. Enabling Allogeneic T Cell-Based Therapies: Scalable Stirred-Tank Bioreactor Mediated Manufacturing. Front Med Technol. 2022 May 30;4:850565.