使用超高效合相色谱(UPC²)分析短杆菌肽

Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones

沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德)

应用效益

■ 快速分离短杆菌肽

■ 载量线性响应

■ 准确、高精度分析短杆菌肽的方法

■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质

沃特世解决方案

ACQUITY UPC²系统

ACQUITY^® SQD

ACQUITY UPC² CSH氟苯基色谱柱

Empower™ 3软件

关键词

超高效合相色谱、UPC²、疏水性肽、短杆菌肽

简介

用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。

在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters^®)超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。

短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。

我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC²系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果——测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。

试验

测试条件

除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。

UPC²测试条件

UPC²系统: ACQUITY UPC²

检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm)

色谱柱： ACQUITY UPC² CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 μm

柱温： 50 °C

样品温度： 15 °C

UPC² ABPR: 1885 psi

进样量： 1 μL

流速： 2.0 mL/min

流动相A： CO₂

流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示)

梯度： 20%至30% B，1.5min

SQD条件

离子源： ES+

锥孔电压： 20 V

毛细管电压： 3.7kV

源温度： 150 °C

脱溶剂气温度： 500 °C

脱溶剂气体流速： 400 L/hr

锥孔气体流速： 25 L/hr

SIR: 922.6,930.3,941.9

数据管理

Empower 3软件

样品描述

用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-μm的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC²系统。

结果与讨论

我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC² CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。

图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相 A：CO2、流动相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。

为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。

图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。

当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。